类器官培养指南大全
—— 一文带您深度了解类器官
类器官(Organoid)是在体外，经过3D培养，能够在体外模拟正常（或疾病）状态下体内器官（或组织）的三维结构和生理功能。通俗点讲，类器官是三维细胞培养物，将干细胞培养于基质胶中，在化学小分子抑制剂/激活剂、细胞因子、培养基添加剂等物质作用下经过培养得到的相应器官类似的组织结构。
类器官拥有自我更新能力，能维持来源组织的生理结构和功能，享有“培养皿中的微器官”之称。利用干细胞的自我更新、分化能力以及自我组织能力，类器官可冷冻保存用作生物库，也能无限扩增。类器官高度复杂，相对于2D细胞，更接近于体内状态。
图1. 人结肠腺癌细胞的类器官培养[1]
类器官的特点是能更好地模拟体内环境，适用于分子和细胞生物学分析，在动物和细胞水平之间，为肿瘤研究、药物筛选、再生医学等领域提供了一个更好的解决方案，已被广泛应用于功能组织诱导、疾病模型建立、药物筛选、抗炎试验、临床端研究等多个方面的研究，在基础研究和转化应用中具有很大的应用前景。
随着类器官培养系统和实验技术的不断发展，类器官培养已用于各种组织和器官，包括肠道（小肠/结肠）、胃、肝脏、心脏、肺、前列腺、胰腺、肾脏、乳腺、脑类、视网膜以及内耳等。
以肿瘤干细胞为来源的类器官也开始在帮助了解肿瘤发生发展机制、筛选药物敏感性、促进精准医疗与个性化诊疗方面展现出巨大潜力。来自Cell、Science多篇文献显示，类器官在预测抗癌药物有效性上，具有极高的灵敏度和特异性。近来，肿瘤类器官已表现出预测患者对癌症药物的反应、帮助制定个性化用药方案方面的作用。
1. 研究发育机制：类器官具有的分化能力，可用于胚胎发育过程及其机制的研究。
调控Wnt、BMP等信号通路诱导的过程，可研究脑类、胰腺和胃等器官的发育。[2][3][4]
2. 建立疾病损伤模型：类器官诱导的特定组织或器官，可用于特定疾病模型的研究。
赵冰、林鑫华团队应用人源类器官感染模型研究新冠病毒(SARS-CoV-2)感染和损伤肝脏的分子机制，为新冠病毒致病机制研究和后续药物开发提供了重要工具。[5]
北大生科院邓宏魁研究组用小分子和细胞因子来刺激，在体外构建了具有损伤再生特征的新型小肠类器官—Hyper类器官。该类器官具有能够长期传代扩增并保持基因组，促进结肠组织的损伤修复，减轻急性结肠炎动物模型的病理学症状等特点。[6]
3. 再生医学：干细胞来源的类器官，能够修复或替代受损或病变的组织以恢复正常的组织功能，在细胞疗法上具有广泛的应用价值，包括用于其他神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病、视网膜病变和脊柱损伤等。
作为再生医学领域的一种新型治疗方式—DA01，利用小分子SB-431542 (Cat#53004ES)、LDN193189 (Cat#53012ES)、CHIR-99021 (Cat#53003ES)和Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES)以及Sonic Hedgehog (Shh)蛋白(Cat#92566ES, Cat#92589ES)，刺激多能干细胞分化为多巴胺能神经元，并移植入晚期帕金森病患者大脑的受伤区域内，为该病的治疗提供新的方向和思路。[7]
4. 药物毒性和功效测试：利用类器官来验证新药在特定器官或组织的药代毒性，为新药研发提供数据支持。
使用Hyman肾脏类器官来验证Cisplatin（顺铂）的肾毒性。[8]
5. 药物筛选：来源于干细胞的类器官能够用于药物反应的离体测试，为药筛提供理论支持。
结肠类器官可用于研究CFTR突变患者的用药方案，肿瘤类器官可用于评估患者的个体化用药情况。[9]
正常类器官主要来源于干细胞，干细胞包括多能干细胞（Pluripotent stem cells, PSCs）和成体干细胞（Adult stem cells, ASCs），其中多能干细胞包括胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）、诱导多能干细胞（Induced pluripotent stems cells, iPSCs）。成体干细胞相比多能干细胞，优势是建模简便快捷，但劣势是构建的类器官结构相对比较简单。多能干细胞构建的类器官结构更为复杂。
类器官培养中常用的小分子（汇总）：超实用，别忘了收藏哦！
❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES) : 是Rock的强效抑制剂，对p160ROCK (Ki=140 nM)和ROCK-II (IC50=800 nM)产生ATP竞争性抑制作用, 也抑制PRK2 (IC50=600 nM)，一般在种板培养的第一次加入，后续换液培养可不添加。Y-27632 (10 µM)处理人胚胎干细胞1 h，可抑制干细胞的凋亡，提高克隆效率，延长细胞的传代。
推荐工作浓度：10 μM
❷ SB-202190 (Cat#53005ES) : 是一种高效的p38 MAPK激酶抑制剂，靶向作用p38α/β。SB202190可诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化，促进神经干细胞的自我更新，可用于胃肠道、乳腺类器官的培养。
推荐溶解浓度：10 mg加入3.018 mL的DMSO溶液溶解到10 mM，-20℃分装保存。
推荐工作浓度：10 μM
❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES) : 是一种氨基嘧啶衍生物, 作为GSK-3 (GSK3α/β)抑制剂，可诱导人胚胎干细胞向内胚层分化，在肾脏和视网膜类器官培养中用到。CHIR-99021和其他试剂结合使用，能刺激体细胞重编程为干细胞。
推荐溶解浓度：5 mg加入3.58 mL的DMSO溶液溶解到3 mM，-20℃分装保存。
推荐工作浓度：3 μM
❹ A 83-01 (Cat#53002ES) : 是Activin/NODAL/TGF-β通路抑制剂，抑制ALK5/4/7激酶活性，一般用于肝脏、前列腺以及乳腺类器官的培养，常被用于抑制iPSCs的分化，维持体外细胞的自我更新。
推荐溶解浓度：5 mg加入5.93 mL的DMSO溶液溶解到2 mM，-20℃分装保存。（特别注意：该产品在溶液状态下不稳定，建议现配现用。）
推荐工作浓度：2 μM
❺ Gastrin I (Cat#53007ES) : 胃泌素是一种内源性胃肠肽激素，刺激胃壁细胞分泌胃酸，是一种非常重要的多肽类激素。胃泌素与胆囊收缩素B受体(CCKBR)结合，提高细胞内Ca2+、促进磷酸肌醇的生成和蛋白激酶C的激活。胃泌素还参与胃上皮细胞的增殖和分化，并用于胃肠道类器官的研究。肠道及肝脏类器官培养时，需要添加胃泌素来延长类器官的存活时间。
推荐溶解浓度：1 mg加入2.38 mL的1%氨水溶液溶解到0.2 mM，-20℃分装保存。
推荐工作浓度：10 nM
❻ Nicotinamide烟酰胺(Cat#51402ES) : 是一种B3维生素，参与多种酶促氧化还原反应，可用于胃肠道、肝脏以及乳腺类器官的培养。烟酰胺与细胞因子、其他生化试剂一起能发挥抗炎特性，并促进间充质干细胞分化成胰岛素生成细胞，抑制sirtuins活性，并用于促进类器官的形成和延长类器官的寿命。
推荐溶解浓度：100 mg加入8.19 mL的H2O（或DMSO）溶解到100 mM，-20℃分装保存。
推荐工作浓度：10 mM
❼ Forskolin毛喉素(Cat#51001ES) : 可以