反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOS)是由15-25个核苷酸单元构成的特异性核酸序列，通过与细胞内核酸杂交成双链结构抑制靶基因转录和翻译过程，从而调控基因表达。反义核酸药物是目前临床研究中最为成功的核酸药物，已有5种反义核酸药物被FDA 批准上市并涉及到了130余个临床试验。然而，无载体递送反义核酸跨膜能力较差且寡核苷酸磷酸二酯键易被核酶水解。为提高反义核酸入胞效率，并对活性作用的发挥进行进一步优化，杨振军课题组主要从寻求高效低毒的载体系统及优化修饰策略入手对其进行研究。

ASOS通常含有完整的磷硫代(PS)骨架，在细胞内可能与许多基因和蛋白质相互作用。G3139是一种以bcl-2 mRNA为靶点，诱导细胞凋亡的反义寡核苷酸。本文报道了一种由胞苷脂质和阳离子脂质(DNCA/CLD，摩尔比28：3)混合的脂材（mix）包装的G3139，可有效抑制MCF/ADR细胞的细胞活性(IC50 158 nM; 未包载G3139的IC50>20 μM)，并表现出较强的抗增殖作用

1. 设计mix

mix可以通过跨越细胞膜释放ASOS到细胞质中。本文研究了DNCA和CLD脂材的最佳混合比例。结果表明，DNCA：CLD，摩尔比28：3的mix所传递的G3139具有显著地抗增殖作用

2. Mix/G3139纳米复合物体外抗增殖和跨膜能力的研究

与lipofectamine 2000（Lipo）相比，mix/G3139纳米复合物同样具有抗癌活性(52.8%vs48.7%)并有效抑制bcl-2 mRNA水平。混合脂质生物活性与高转染效率相容。进一步地共聚焦显微镜分析表明，mix/G3139纳米复合物主要分布在细胞质和细胞核中。这说明mix能有效地增强ASOS的通透性，增强跨膜转移，其转染效率与Lipo相同甚至优于Lipo。

3.Mix/G3139纳米复合物在体内的生物分布

利用活体成像技术对Mix/G3139纳米复合物在体内的生物分布和代谢进行监测。对携带乳腺癌肿瘤的小鼠进行肿瘤周围注射给药。结果表明，随着给药时间的延长，荧光强度明显降低，脂质纳米粒延长了G3139的存活时间，并提高了药效。

4. PS或Gapmer修饰引起的生物变化

用PS修饰ASOS的末端和中心（ns-0103，ns-0709和ns-1316）表现出比N-G3139更显著的抗癌活性(a)。包载13-16位点PS修饰序列的G3139抗癌活性最高（b）。结果表明，与F-G3139相比，G3139的双末端三位点锁核苷修饰（LNA-G3139）显著降低了细胞存活率 (21.5vs35.5%; c)和bcl-2 mRNA的表达(14.5%vs25.6%; d)。LNA-gapmer显著促进了抗增殖作用和细胞凋亡(e)。

5. 体内抗肿瘤作用及毒性

mix/G3139组肿瘤生长水平相对低于空白组和mix/NC组(a)。与mix/G3139组相比，mix/LNA-G3139组11天后肿瘤生长明显受到抑制。免疫组织化学分析表明，mix/G3139和mix/LNA-G3139纳米复合物能有效地降低bcl-2蛋白的表达(e)。数据表明mix/ LNA-G3139纳米复合物具有显著地抗肿瘤活性，对肝脏和肾脏几乎没有毒性并没有激活体内免疫。

6. 修饰后的G3139S功能机制及体外转录和蛋白质组学分析

LNA-G3139修饰后，可增强其与互补RNA亲合力，提高靶基因沉默效率，在更低给药浓度下(IC50 112 nM)发挥显著地肿瘤细胞增殖抑制作用。基于转录组学和蛋白组学等机制研究揭示，LNA-G3139也显示了更强的与肿瘤细胞生长相关基因ATAD3A, AARS的亲和性，显著下调以上基因相关mRNA及蛋白的表达，协同发挥抗肿瘤活性。